Inflamm Regen︱吴安国/秦大莲/吴建明团队揭示苗药赶黄草活性单体改善阿尔兹海默症相关病理学

撰文︱张   丽

责编︱王思珍

编辑︱杨彬薇

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的神经退行性疾病，占所有痴呆病例的三分之二。它的特点是神经元和突触的进行性丧失，以及认知和记忆力的下降。老年斑中β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）的细胞外沉积和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT）中的细胞内过度磷酸化Tau是AD的两个主要病理特征。尽管目前针对AD临床药物的研究已经取得了巨大的成果，但尚无药物可以逆转或者抑制进展期的疾病进程。

小胶质细胞是一种遍布大脑和脊髓的常驻巨噬细胞，它们不断清除中枢神经系统中的斑块以及受损或不必要的神经元和突触。现有证据表明，聚集的错误折叠蛋白（如Aβ和Tau）会诱导促炎反应，并最终导致认知和记忆力下降[1,2]。此外，NLRP3炎症小体被发现在 AD患者的大脑中被激活，小胶质细胞中的促炎细胞因子水平增加，而持续的促炎反应进一步加重了AD的病理学和进展[3,4]。此外，自噬是细胞的分解代谢过程，自噬不足会加重AD的发病机制[5]。因此，靶向小胶质细胞自噬以清除错误折叠的蛋白质和抑制 NLRP3炎性体被认为是一种有前途的AD治疗策略。因此，发现针对Aβ诱导的NLRP3 炎性体降解的强效自噬诱导剂已成为当前研究的关键工作。

吴安国课题组与澳门罗婉君课题组前期从中药赶黄草（Penthorum chinense Pursh，PCP）中提取分离出四种鞣花单宁黄酮类化合物，包括pinocembrin-7-O-[4″,6″-hexahydroxydiphenoyl]-glucoside（PHG）、pinocembrin-7-O-[3″-O-galloyl-4″.6″-hexahydroxydiphenoyl]-glucoside（PGHG）、thonningianin A（TA）和thonningianin B（TB），能够诱导HUVECs 中的自噬[6]，但这其激活自噬的分子机制和对AD的潜在治疗作用仍不清楚。

近日，西南医科大学药学院的吴安国/秦大莲/吴建明团队在Inflammation and Regeneration上发表了题为“Targeting microglial autophagic degradation of the NLRP3 inflammasome for identification of thonningianin A in Alzheimer's disease”的文章，阐述了TA是如何激活自噬的，并把自噬激活，NLRP3炎性小体降解和改善AD相关病理学联系起来。

首先作者探索了TA在BV-2和小鼠原代小胶质细胞中的自噬诱导作用。结果显示，TA提高了BV-2细胞中LC3-II/LC3-I的比例和小鼠原代小胶质细胞中GFP-LC3斑点的平均数量（图1）。为了进一步表征TA诱导的自噬通量的早期和晚期阶段，作者使用了LY和HCQ两种自噬抑制剂，发现LY显着降低了TA诱导的LC3-I 向LC3-II的转化以及每个细胞的GFP-LC3斑点的平均数量。相反，HCQ进一步促进了 LC3-I向LC3-II的转化，增加了TA诱导的GFP-LC3斑点的平均数量（图1）。上述数据表明TA在小胶质细胞中诱导自噬通量。

图1    TA 在小胶质细胞中诱导自噬通量

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

随后作者进一步探索了TA激活自噬的具体分子机制。发现TA显着上调p-AMPK和p-ULK1水平并调节Raf、MEK和ERK磷酸化的蛋白表达，表明TA 激活了AMPK/ULK1和Raf/MEK/ERK信号通路（图2）。然后，作者采用了CC（AMPK抑制剂）、SBI（ULK1 抑制剂）和SCH（ ERK抑制剂）进行验证。结果显示，CC、SBI和SCH显着降低了GFP-LC3斑点的平均数量和LC3-II/LC3-I的比率（图2）。此外，SCH显着抑制AMPK和ULK1磷酸化的蛋白表达。同样，CC也抑制了Raf、MEK和 ERK磷酸化的蛋白质表达。并且SCH和CC协同处理降低了TA处理的BV-2细胞中 LC3-II/LC3-I的比率（图2）。这些数据表明AMPK/ULK1和Raf/MEK/ERK可能相互作用并协同促进TA诱导的BV-2细胞自噬。总之，TA主要通过激活小胶质细胞中的 AMPK/ULK1和 Raf/MEK/ERK信号通路来诱导自噬。

图2    TA通过AMPK/ULK1 和 Raf/MEK/ERK 信号通路诱导自噬

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

研究表明，在刺激错误折叠的蛋白质后，NLRP3被激活，并且从过度活化的小胶质细胞中释放出一定量的促炎细胞因子[7]。而自噬可负调节促炎反应，并下调小胶质细胞中的IL-1β等促炎细胞因子水平[8]。作者发现TA（2-10μM）对BV-2细胞的形态和吞噬能力没有显着影响（图3）。然后研究了TA对NLRP3炎性体的抑制作用，发现TA抑制了Aβ(1-42)诱导的NLRP3炎性体的过度激活以及IL-1β等促炎细胞因子的水平，而LY显著减弱了TA的作用。同时，共聚焦显微镜图像显示TA诱导了GFP-LC3 和ASC斑点的共定位（图3），直接证明TA通过自噬降解机制抑制NLRP3炎性体。以上数据表明，TA通过自噬抑制Aβ(1-42)诱导的BV-2细胞中NLRP3炎性体的过度活化。

图3   TA 促进 Aβ（1-42）诱导的 BV-2 和原代小胶质细胞中 NLRP3 炎性体的自噬降解

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

随后，作者使用CC和SCH进一步探索了TA对NLRP3活化的抑制作用是否与AMPK/ULK1和Raf/MEK/ERK信号通路有关。结果显示，CC显着降低TA诱导的AMPK 磷酸化并减弱TA对NLRP3、caspase-1等相关蛋白表达的抑制作用（图4）。此外，SCH显着降低了TA诱导的ERK磷酸化和TA对NLRP3活化的抑制作用（图4）。上述数据表明，在BV2细胞中，TA 通过AMPK/ULK1和 Raf/MEK/ERK信号通路介导的自噬抑制Aβ（1-42) 诱导的NLRP3的激活并降低促炎细胞因子的水平。

图4  TA 通过 AMPK/ULK1 和 Raf/MEK/ERK 介导的自噬抑制 Aβ(1-42) 诱导的 NLRP3 炎性体激活

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

作者接下来使用MTT、Hoechst33342/PI染色和流式细胞仪等方法，测量了使用条件培养基培养的PC-12细胞和小鼠原代海马神经元的细胞活力。结果显示，TA增加了PC-12 细胞和小鼠原代海马神经元的活力，并降低了细胞凋亡率和PI/Hochest比率（图5）。而LY、CC和SCH等抑制剂逆转了TA对PC-12细胞损伤的改善作用（图5）。此外，TA还抑制了Aβ等错误折叠蛋白对神经元的损伤。同时，作者检测到TA在小鼠原代海马神经元中的自噬诱导。以上数据表明，TA可能通过自噬改善由神经炎症过度激活和错误折叠蛋白（如 Aβ）过度积累引起的神经元损伤。

图5  TA 可改善由 Aβ(1-42) 诱导的小胶质细胞中 NLRP3 炎性体激活引起的神经元损伤

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

作者接下来验证了TA在秀丽隐杆线虫体内的自噬作用，发现TA和Rap显着降低荧光强度和p62的相对mRNA表达，并增加了线虫中GFP-LGG-1阳性斑点的形成（图6）。因此，TA被证明在秀丽隐杆线虫中诱导自噬。之后作者又研究了TA在多种秀丽隐杆线虫AD模型中的神经保护作用，发现TA显着减弱了BR5270菌株的食物搜索不足和线虫前部区域的Aβ沉积物（图6）。此外，TA在CL4176线虫中表现出Aβ(1-42)诱导的麻痹的显着延迟，然而在敲除关键自噬相关基因后，此作用被抑制（图6），表明TA通过诱导自噬抑制了CL4176的麻痹。以上数据表明，TA诱导了自噬，清除了Aβ，并改善了秀丽隐杆线虫的行为表现。

图6  TA 在秀丽隐杆线虫中诱导自噬并表现出神经保护作用

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

接下来作者使用APP/PS1小鼠进一步研究TA是否能改善认知障碍并抑制体内Aβ和凋亡蛋白的表达。作者首先证明了TA在APP/PS1小鼠上腹腔给药的安全性。然后采用MWM测试，发现TA增强了空间学习和记忆能力（图7）。此外， TA降低了APP/PS1小鼠脑中Aβ和凋亡相关蛋白（包括caspase-9和Bax/Bcl-2）的表达，并且还改善了脑内Aβ的沉积，增加了NeuN阳性神经元的数量，并抑制了Bax和TUNEL阳性神经元的表达（图7）。上述数据表明，TA改善了APP/PS1小鼠的认知功能，改善了Aβ病理和神经元损伤。

图7  TA 改善认知功能并改善 APP/PS1 小鼠的 Aβ 病理学和神经元损伤

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

最后，作者验证了TA是否在小鼠中诱导自噬并抑制NLRP3炎性体的激活。结果显示，TA显着提高了LC3-II/LC3-I的比率并抑制了NLRP3炎性体的活化（图8）。为了证明 TA诱导的自噬在小胶质细胞中特异性发生，作者使用免疫荧光法对LC3和CD45进行双重免疫染色，发现TA显着减少了CD45的斑点数量，同时增加了LC3的斑点数量和LC3与CD45的共定位（图8）。此外，TA降低了APP/PS1小鼠大脑中IL-1β、IL-18、NLRP3、TERM2和GFAP的水平（图8）。这些数据表明TA可能通过自噬抑制了NLRP3介导的炎症反应和小胶质细胞与星形胶质细胞的过度激活。并且蛋白质印迹结果表明TA显着增加了AMPK、ULK1、Raf、MEK和ERK磷酸化的蛋白表达（图8）。以上数据表明，在APP/PS1小鼠中，TA 通过AMPK/ULK1和 Raf/MEK/ERK 介导的自噬抑制NLRP3 炎性体。

图8   TA能通过 AMPK/ULK1 和 Raf/MEK/ERK 介导的自噬抑制NLRP3 炎性体的激活

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

图9  TA作用机制图

（图源：Zhou, XG. et al., Inflamm Regen, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

在该研究中，作者证实了TA在BV-2细胞中的最强自噬诱导作用，并进一步阐明了TA诱导自噬的分子机制。TA通过AMPK/ULK1诱导自噬，但不依赖于mTOR信号通路，并且AMPK/ULK1和Raf/MEK/ERK相互作用并协同促进了TA诱导的自噬的调节。此外，作者还证明了TA可以通过AMPK/ULK1和Raf/MEK/ERK信号通路促进Aβ(1-42)诱导的BV-2 细胞中NLRP3炎性体的自噬降解，并改善秀丽隐杆线虫和APP/PS1小鼠的认知和行为功能。这些数据提示TA可能是未来防治AD的一种潜在的新型治疗药物。此外，作者还利用网络药理学理论来探索TA的潜在靶点。通过靶点预测和蛋白相互作用网络研究，结合分子对接模拟，发现HSP90是调控AMPK/ULK1和Raf/MEK/ERK信号通路所涉及蛋白的关键靶点。同时，分子对接显示TA与HSP90AA1的SYBLY模拟结合得分高达9.91，提示HSP90可能是TA调控AMPK/ULK1和Raf/MEK/ERK信号通路的直接靶点。不足的是，作者这一预测并没有通过实验验证和深入研究TA对HSP90的调节作用。

原文链接：10.1186/s41232-022-00209-7

通讯作者：吴安国（左），秦大莲（中），吴建明（左）

（照片提供自：西南医科大学吴安国/秦大莲/吴建明团队）

作者简介（上下滑动阅读） 

吴安国，西南医科大学副教授，四川省“千人计划”高层次创新团队核心骨干。硕士研究生导师。四川省青年联合会理事，中国药理学会会员，四川省药理学会会员，四川省药理学会肿瘤药理专委会委员，四川省药理学会心脑血管专委会委员；世中联中医药免疫专业委员会理事。近3年研究成果发表在Signal Transduction and Target Therapy, Acta Pharmaceutica Sinica B, Aging Research Reviews， Inflammation and regeneration, Clinical Immunology，Pharmacological research等SCI期刊发表SCI论文50余篇，高被引论文3篇。主持国家自然科学基金及省部级课题多项。获得2014年澳门博士研究生科技研发奖。

秦大莲，西南医科大学药学院药理学教授，四川省“千人计划”高层次创新团队核心骨干。硕士研究生导师，四川省药理学精品课程负责人，药理学优秀教学团队负责人，药理学重点培育学科负责人。在职期间，多次被评为学校优秀教师，并获“良师益友”“教学名师”“优秀指导教师”称号及“金教鞭”奖励。已培养硕士研究生19名。近5年，主持及主研国家自然科学基金、省部级科研项目多项。发表SCI论文50余篇。

吴建明，西南医科大学教授，基础医学院院长，四川省教育厅创新团队负责人，"酒城英才"创新团队负责人，博士生导师，博士后合作导师，四川省杰出青年科技人才，国家科技部及省科技厅评审专家，中国药理学会中药与天然药物药理专委会青委会常务委员、四川省“千人计划”高层次创新团队核心骨干，主要从事中药对造血机能与神经退行病变的调控，及药物筛选及成药性评价。主持国家自然科学基金面上项目及国家科技部项目共4项，省部级及其他各类项目20余项。发表学术论文120篇，SCI收录79篇，其中ESI高被引论文3篇，他引大于1430次，单篇最高他引431次，总IF为442.943；申请专利24项，参与撰写论著3部。获2013年四川省科技进步一等奖, 2020年四川省科技进步二等奖。

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完